近日，陆燕、刘鹏渊课题组在《Molecular Cancer》（IF=7.776）上发表了题为“Exosomal let-7d-3p and miR-30d-5p as diagnostic biomarkers fornon-invasive screening of cervical cancer and its precursors”的研究论文（https://doi.org/10.1186/s12943-019-0999-x）。该研究发现血浆外泌体中的miR-30d-5p 和 let-7d-3p是非常有价值的宫颈癌及癌前病变无创筛查的诊断标准物。

宫颈癌是威胁女性的三大癌症之一，然而从癌前病变时期到癌变期，过程长达几年甚至十几年之久，高准确率的早期筛查技术是改善宫颈癌发病率和死亡率的关键之一。目前临床上宫颈癌早期筛查的手段是宫颈巴氏涂片检测（Pap smear Test）或者薄层细胞学检测（thinprep cytologictest，TCT），但是其准确率和接受度都有极大的可提升空间。外泌体为30-100nm大小的囊泡，是液体活检技术的三大媒介之一，大量存在于人体组织液中。利用外泌体的液体活检技术可用于肿瘤的早期筛查、检测、用药指导、检测等，可以为宫颈癌早期筛查提供新的方法和应用前景。

本研究结合二代测序技术和分子生物学技术，对包括正常志愿者和CINI期患者，CINII期以上患者的血浆样本进行外泌体miRNA的二代测序，利用高通量测序数据和机器学习方法，比较不同组别之间的miRNA表达谱，找寻各组间有差异的特征miRNA分子。在宫颈癌病人的癌组织和癌旁组织中利用qRT-PCR的方法进行差异miRNA的表达验证，验证出与测序数据的变化趋势一致且差异显著的miRNAs（图1）。之后利用微滴式数字PCR（ddPCR）在200多个独立的血浆样本中验证出了2个miRNAs（miR-30d-5p和let-7d-3p）。在CINI-组和CINII+组中，miR-30d-5p和let-7d-3p的表达差异显著（p<0.01）。两个miRNAs分子联合使用进行分类时，ddPCR结果的AUC值可以达到0.828；两个miRNAs分子与细胞学检测结果联合使用具有更好的分类效果，比单用细胞学检测结果的准确率提高了12%（图2）。利用DIANA数据库对差异变化的miRNAs，进行了靶向基因的富集通路分析，其中与超过5个miRNAs有显著关联（p<0.01）的通路有25个，包括多个癌症相关的通路，如细胞周期通路、p53信号通路、癌症通路、癌症相关蛋白聚糖通路、AMPK信号通路和癌症转录失调通路等。除此之外，还有一些与癌症相关的妇科疾病通路，如位列第一的病毒致癌通路、细菌侵入上皮细胞通路、HTLV-1病毒感染通路、卵母细胞减数分裂通路等。其中不乏重要的癌症相关基因，如RAC1、IGF1R、NRAS、TP53、CCND1、CDC27、YWHAG、CDK6和MAP3K1（图1）。

该研究基于生物信息分析和分子实验技术，利用正常志愿者和宫颈癌患者之间不同的外泌体miRNA表达谱，开发了基于液体活检的方便、低风险、高准确率的癌症早期诊断方法。能够改善和弥补目前宫颈癌诊断技术的缺点和不足，以CINI期到CINII期为分界线，及早鉴定出患者癌前病变的风险，有效减少宫颈癌的发病率和死亡率。该研究筛选出2个外泌体中的miRNA作为宫颈癌早期筛查的肿瘤标志物，为肿瘤诊治和检测提供服务，是极具潜力性和前瞻性的，为后期更深入的研究提供重要参考依据。

该研究由浙大妇院和转化医学研究院双聘教授陆燕、邵逸夫医院和转化医学研究院双聘教授刘鹏渊团队与浙大妇院吕卫国教授团队合作完成，浙江大学附属妇产科医院为第一完成单位。陆燕教授为本文通讯作者，转化院2015级硕士研究生郑梦月、浙大妇院技术员侯苓和检验科马裕为论文的共同第一作者。此外参与研究的还包括浙大妇院病理科吕炳建副主任、妇科肿瘤科王芬芬副主任医师、程蓓主任医师和省同德医院检验科的王伟主任。相关工作也得到了国家重大研发计划和国家自然科学基金等项目的支持。

图 1 测序数据的生信分析结果。A: 各组患者样本与正常志愿者样本间差异表达miRNAs的韦恩图。B: 各组患者样本与正常志愿者样本间差异表达miRNAs的PCA图。C: 各组患者样本与正常志愿者样本间差异表达miRNAs的聚类图。D-F: 机器学习法挑选的最佳差异表达miRNAs组在CINI-与CINII+组间的PCA图，聚类图和ROC曲线图。G-H：最佳差异表达miRNAs中下调miRNAs和上调miRNAs的盒型图和ROC曲线图。I: 最佳差异基因miRNAs的target基因的 KEGG通路富集图（p<0.01）。J: 最佳差异基因miRNAs的共同target基因联络图。

图 2 miRNAs数字PCR验证结果图。A: let-7d-3p的ddPCR结果和ROC曲线。B: miR-30d-5p的ddPCR结果和ROC曲线。C: 该两个miRNAs结合的二代测序数据的ddPCR数据的ROC图。D: 外泌体miRNAs检测、细胞学检测和两者联合检测的ROC图。